基於（yú）FELASA實驗小鼠（shǔ）遺傳質（zhì）量控製和遺傳檢測工作組的報告，本公眾號（hào）前期文章《實驗大小鼠的（de）遺傳質量控製和遺傳監測: 標準化（huà）實驗（yàn）大（dà）小鼠分類（lèi）》一文介紹了常見標準化齧齒類動物和幾種獲得遺傳工程齧齒動物的基本方法。本文將繼續依據該（gāi）報告的內容，重點介紹如何進行小鼠遺傳質量控製和遺（yí）傳（chuán）監測。

當（dāng）你的設施有新（xīn）構建或者引入一種GA（Genetically altered）齧齒類動（dòng）物時，應完整記錄這（zhè）些動物的詳細信息。同時，這（zhè）些信息也（yě）必須伴隨著相（xiàng）應動物品係一起傳遞給所有可能會使用它的研究（jiū）者。這些信息包括但不（bú）限於：正確的品係名稱、對於突變的完整描述、動物的遺傳（chuán）背景、基因鑒定（dìng）方案和相關表型（xíng）描述等。設施（shī）管理者可以（yǐ）設計一些固定格式的表（biǎo）格用於（yú）記錄這些信息。

關於命（mìng）名法重要性的概述，可以參考“FELASA轉（zhuǎn）基（jī）因齧（niè）齒動物生產和命名指南”。沒有一個公認的命（mìng）名法（fǎ），就不可能準確（què）地交流科學成果。同（tóng）時模（mó）糊或不完整的命名會引發（fā）錯誤，會使（shǐ）實驗結果的可重複性降（jiàng）低。因此（cǐ），應根據國際命名（míng）規則命名不同（tóng）品係。特別是當（dāng）同一品係被保存在世界各地不同的設施或它們被加入數據庫中時，這一點（diǎn）顯得尤為重要。指導命名的規則由國際小鼠和大鼠標準（zhǔn）化遺（yí）傳命（mìng）名委員會製定，並不斷更新。這些規則（zé）最近一（yī）次修訂（dìng）是在（zài）2016年1月，在（zài）MGI網頁的“小鼠和大鼠（shǔ）品係（xì）命名指南”中有詳細描述。

遺傳變異的來源

齧齒類動物設施麵臨的一個重要挑戰是保持近交係（xì）的遺傳背景純正，並將GA係動物維持在明確的（de）遺傳背景之下。近交係的遺（yí）傳變異可能由以下因素（sù）產生（shēng）：（a）意外的雜交造成的汙染；（b）由（yóu）於殘留的雜合性或新的自發突變的固定造成的遺傳漂變。遺（yí）傳（chuán）變異的引入通常有以下幾種途徑：

（1）遺傳汙（wū）染

來自一個近交係的個體與另一個來源的（de）動物意（yì）外交配導致的基因汙染（rǎn）是近交係中遺傳（chuán）譜係（xì）改（gǎi）變的最（zuì）重要來源。這（zhè）種類型的基因汙染會導致等位基因發生突然的大（dà）規模改（gǎi）變，尤其在具有相同被毛顏色的品係中更容易發生（shēng），例如帶有白化等位基因(Tyrc /Tyrc )、agouti(A/A)或（huò）非agouti(a/a)的品係之間。因此在飼養（yǎng）具有相（xiàng）同被毛顏色的不同品係動物時需要格外小心，盡可能防止其近距離（lí）接觸。有關（guān）小鼠毛色遺傳，可參閱本號前文（wén）《小鼠的毛色是如何形成的？》

（2）自發突變

自發突變是在個體中由於自然存在的誘變（biàn）劑或DNA複（fù）製、轉錄、修複時偶然出（chū）現的（de）堿基配對錯誤而產生的突變，是一種不受控製（zhì）的遺（yí）傳變異來源，通常無法通（tōng）過簡單（dān）的表型（xíng）觀察或者常規的遺傳監測（cè）發現。

（3）遺傳漂變

遺傳漂變是（shì）指某個小群體中，由於新（xīn）突變的出現以及殘留雜合性的等位基因逐步固化在純合狀態，並取代了原來的等位基因的過程。

當同一品係在不同地方獨（dú）立繁殖時（shí），遺傳漂變（biàn）對品係的分（fèn）化（huà）和亞品係的產生有不（bú）可忽視的作用。小鼠亞（yà）品係的例子很多，例如（rú），已發現有10個有記錄的BABL/c亞（yà）係（xì）和15個C57BL/6亞係，包括來自傑克遜實驗室的（de）C57BL/6J和來自美國國（guó）立衛生研究院（NIH）的C57BL/6N亞係。同樣，許多大鼠近交（jiāo）係也至少有兩個（gè）亞係，例如SHR至少有四個亞係，包括SHR/Ola和（hé）SHR/NCrl；WKY和F344至少各有三個亞（yà）係。

（4）乘客突變

乘客（kè）突變是指（zhǐ）隱藏在亞係或者是GA係動物的基（jī）因組中的突變，這些（xiē）突變在某些特定情況下能夠影響到動物實驗結果（guǒ）。例如（rú）在最常見的C57BL/6中的兩個亞係C57BL/6J和C57BL/6N，由於一些自發的突變，如C57BL/6N中出現了可導（dǎo）致視網膜退變（biàn）的Crb1rd8突變，而C57BL/6J中則出現了Nnt基（jī）因的缺失。正（zhèng）因這類乘客突變（biàn）的存（cún）在，在進行表型分析時，要特別注意觀察到的表型是由（yóu）於目標基因的修（xiū）飾還是遺傳背（bèi）景中存在的（de）突（tū）變造成的，並藉此選（xuǎn）擇合適的對照組動物。

遺傳質量控製（zhì）方案

目前（qián）實驗齧齒類動物的遺傳質量控製金標準是依靠遺傳標記多態性來區分不同的（de）遺傳背景。

遺傳標記是染色體上已知位置（zhì）的特（tè）定DNA序（xù）列（liè），是遺傳質（zhì）量控製的基（jī）本工具。遺傳質量控製對確定動物的遺傳組成，確定（dìng）品係的（de）一致性和真實性是必要的。值（zhí）得注意的是，一般不會對封閉群動物進行遺傳（chuán）標記（jì）一致性的檢測，相反，應該（gāi）對（duì）封（fēng）閉群動物的遺傳異質性水平進（jìn）行確認，以檢測遺傳汙染（rǎn），監（jiān）測育種方案的科學性。

標記係統

大鼠和小鼠中已經發現多種多態性，然而，在目前的質量保證方案中，隻有微衛（wèi）星DNA和SNPs被用作遺傳標記（jì）物。微衛星標記，又被稱為短串聯（lián）重複序列(short tandem repeats,STRs)或簡單重複序（xù）列（simple sequence repeats，SSR），是均勻分布於真核（hé）生物基因組中的簡單重複序列，其典型結構是由（yóu）2～6個核苷酸的序列串聯（lián）重複幾次到幾十次構（gòu）成（chéng），這種重複造就了染色體之間的等位基因（yīn）多樣性。微衛星標記（jì）通常先通過PCR方式（shì）擴增包含微衛星序列的區（qū）域，再對（duì）擴增產物通過電泳分析和片段大小進行等位基因差異分析。

SNP分型是微衛星標記的（de）一種替代方法，現在應用範圍（wéi）更廣。SNP多態（tài）性是指（zhǐ）在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列（liè）多（duō）態性，編碼區和非編碼區都有SNP的存在。

傑克遜實驗室的Petkov和他的同事從48個（gè）小鼠品係中的235個SNPs的等位基（jī）因中選擇了28個SNP，這些位點已足（zú）以區分傑克遜實驗室所保存的約300個（gè）近交係、野生型、同類係、染色體（tǐ）置換係和重組近交係中的大多數動物。一些研究者也報道了大鼠（shǔ）可用的SNPs。例如，Zimdahl和他的同事描（miáo）述了來自轉錄區的超過（guò）12,000個SNPs。

近交係和遠交係的（de）遺傳監測

目前（在（zài）歐美國家）使用的主流的（de）遺（yí）傳監（jiān）測（cè）技術（shù）是基於微衛星或SNPs 的檢測。然而，我們建議，除了分子技術，同時也應該監測動物的表型參數，如毛色、行為和繁殖能力等。商業育種者對控製遺傳汙染的發生應（yīng）更為重視，並定期監測其品係的遺傳質量。傑克遜實驗室采用了一種獨（dú）特的、已獲專利的遺傳穩定計劃，即通過每五代就重新從純種的、冷凍的胚胎中重建他們的基（jī）礎種群來（lái）有效（xiào）地限（xiàn）製遺傳漂變的積累（lèi）。例如，從2005年開始，他（tā）們出售的C57BL/6J小（xiǎo）鼠都是兩隻選定的小鼠的（de）後代，而他們冷凍的數百（bǎi）個胚胎（tāi）足以持續使用25-30年。特別需要注意（yì）的是，當從冷凍庫存（cún）中複蘇胚胎時，也應進行遺傳檢（jiǎn）測，以確（què）保冷凍前及冷凍過程中沒有發生遺傳（chuán）汙染（rǎn）或其他錯誤。

對於遠交（jiāo）係，遺傳監測有助於保持（chí）群體的遺傳多樣性和等位基因庫（kù）。這個過程更為複雜（zá），需要分析大量的動（dòng）物，並（bìng）將這（zhè）些數據與曆史數據（jù）進行比較，記錄（lù）存在的等（děng）位基因、它們的（de）頻（pín）率（lǜ）和該特定群體的雜合度（dù）水平。在某些（xiē）情況（kuàng）下遺傳多樣性缺失的結（jié）果會導致一個群體（tǐ）的異質性降到較低水平（píng）。低異質性可（kě）能是源（yuán）於繁殖種群的選擇不當，繁育體係執行中（zhōng）的偏（piān）離，或是起始的繁殖群體過小。相反（fǎn），過高的異質性可能是由近期出現的遠交造成的。大體上，需通過測量表型性狀和（hé）計算相應的平均值（zhí）和標準差來描述遠交係的基本特征。對遠交係遺傳（chuán）控製的原則是避免（miǎn）近親繁殖並在（zài）各代中保持（chí）其遺傳（chuán）多樣性。

自繁（fán）近交係（xì）小鼠和大鼠的遺傳監測

建（jiàn）議（yì）從可靠的供應商（shāng）購處買動物（wù），並在10代後用同一（yī）供應商的動物替換繁殖種群，不建議（yì）長期維持經典近（jìn）交品（pǐn）係（xì）的獨立（lì）種群（qún）。使用來自同一供應商的動物可以（yǐ）有效的防止產生突變的亞（yà）品係（xì）。同時，自繁動物也應（yīng）該用微衛星標記或SNPs檢測（cè）進行（háng）遺（yí）傳質量監測，以確保其遺傳質量（liàng）的可靠性。

微衛星檢測可以用於驗（yàn）證近交（jiāo）係小鼠品係背景的純度，是否有遺傳汙染的痕跡。這對（duì）於在同一飼養間（jiān）內飼養具有相同毛色的品係的動物設施，尤其是在不使用IVC籠具的（de）設施來說尤其重要。微衛星檢測（cè）的標記物數量尚（shàng）未標準化（huà），標（biāo）記物的選（xuǎn）擇應根據設施維持品係的種類和數量進行相應的調整。

由於近交係動物的基因序列高度一致，基因都是純合的，當對一個特定的微（wēi）衛星位點進（jìn）行基因分型（xíng）的（de）時（shí）候，在電泳（yǒng）時隻會呈現單一條帶，代表（biǎo）一個等位基因，而任何雜合性的存在，例如（rú）有兩個條帶或者與對照組條帶大小不一致時，就應該被視為有潛在的汙染（圖1）。

圖1. 通過（guò）SSLP PCR檢測基因汙染（rǎn）的例子

圖片是PCR擴增後得到的特（tè）征條帶，這些條帶來自四隻據（jù）稱屬於BALB/c品係的（de）小鼠的基因組DNA(每組的（de）前四個泳道)，加上BALB/c的標準DNA對照(最後一個泳道（dào）)。本圖片（piàn）隻顯示（shì）了位於1至5號染色體上的五個SSLP位點。可見存在（zài）雜合性(兩條帶)和不符合BALB/c標（biāo）準（zhǔn）的條帶大小（xiǎo）的條帶存在。

對於種群數量較（jiào）小，且采用隔離飼養，也沒有高頻次動物引進的設施，每兩年一次檢測就可以有效的監測動物遺（yí）傳質量。

使用SNP組監測動物遺傳質量時，利用均勻分布在染色體上的四十（shí）多個SNPs就可以有效（xiào）檢出近期發生的遺傳汙染，檢測位點數量（liàng）可根據（jù）每個機構的實際情（qíng）況和設施麵對的風險程度而（ér）定。SNP基因分型目前可以在不同的平台上進行，其成本（běn）和自動化能（néng）力各不相同。Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)和Taqman實時熒光定量PCR是常（cháng）用的檢測方式，相比較而言（yán），前者的（de）自動化程度更（gèng）高，成本更低，但對檢測樣本量的下限有一定要求。

遠交係種群的遺傳質量監測

遠交係的（de）遺（yí）傳質量監（jiān）測（cè）比近交係要複雜（zá）的多，因為這些動物的（de）基因並不一樣，它們本質上是一群密切相關的（de）動物，有共同的祖先和群體特征，但表現（xiàn）出一（yī）定程（chéng）度的遺（yí）傳多樣性，所以僅僅（jǐn）用少量的遺傳標記就很難建立（lì）一個標準的遺傳（chuán）監測方案。然（rán）而，通（tōng）過監測足夠數量的SNPs或者（zhě）SSLPs位點，就可（kě）以說（shuō）明群體內的等位基因頻率和種群的遺傳特征。

遠交係遺傳質量控製麵臨的主（zhǔ）要問題（tí）之一是，許多管理者用非常小規模的繁（fán）殖種群，導致種群中有代表（biǎo）性的等位基（jī）因數量減少（shǎo），增（zēng）加了近親繁殖係數，這種種群既不是真正意義上的遠交係，也不是近交（jiāo）係。因此，如果無法維持適當基數的繁殖種群的時候（hòu），就建（jiàn）議從那些有大規模繁殖種群（qún）的供應商處購買遠交係動物，或者遵循推薦的（de）繁殖方案，以減少近親繁殖。

參考（kǎo）文獻：

[1] Benavides F , T Rülicke,  Prins J B , et al. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report:[J]. Laboratory Animals, 2020, 54(2):135-148.