最近驚聞一位朋友因患一種名為肝豆狀核變性的罕（hǎn）見病（bìng）而離世，突感罕（hǎn）見病並不罕見，它（tā）往往就在我們身邊。因筆（bǐ）者對肝豆狀核變性（xìng）研究有所涉獵，本文將對該病（bìng）及其動（dòng）物模（mó）型作簡要介紹（shào）。

01、首次發現及致病機製

肝（gān）豆狀核變性又名Wilson病(Wilson’s disease，WD) ，1912年首（shǒu）次由（yóu）Samuel Kinnear Wilson博士描述。該病表現（xiàn）為“漸進（jìn）性豆狀核退化”，在患者的肝髒和（hé）大腦等器官中發現了過量的銅，該病在全球（qiú）的患病率約為1/30000。經過多年研究，肝豆狀核變性（WD）的發（fā）病機製已經研究的較為清楚，它是一種常染色體隱性遺傳銅（tóng）代謝障礙疾病[1]。1993年三個獨立研究小組幾乎同（tóng）時發現了ATP7B基因為Wilson病（bìng）的致病基因。該基因編（biān）碼銅轉運P型（xíng） ATP酶 ( copper-transporting P-type ATPase，ATP7B)[2]，WD患（huàn）者（zhě）攜帶（dài）發生突變（biàn）的ATP7B基因，血清銅藍蛋白合成及（jí）正常的銅代謝過程發生障礙，過量的銅沉積在（zài）組織（zhī）器官中，如肝髒、大腦、腎髒、角膜中，其中最常受累（lèi）的（de）是肝髒和神經係統[3]。

圖1.ATP7B蛋白結構圖

圖注：N-端包含六個結合銅的金屬結合結構域（MBD1-MBD6，青色）；參與Cu配位的殘基在膜內（nèi）的位（wèi）置為CPC、YN和MXXXS；位於C末端的兩（liǎng）個亮（liàng）氨酸基序（1459LL和1487LL）對胞吞（tūn）作用和TGN從質膜重新定位至關重要[4]。

02、臨床表現及診斷

WD患者在臨床表（biǎo）現上包括嚴重程度不等的肝損傷（shāng）、持續性血清轉氨酶升高、急性或慢性（xìng）肝炎、代償期或失（shī）代償期肝硬化和暴發性肝功能衰竭等[5]。神經係統的（de）表現以椎體外係病變症狀為主，包括僵硬、震顫、運動遲緩、構音障礙、吞咽障礙、舞蹈症狀、癲癇發作等，精神症狀包括躁狂、性格改變、抑鬱等[6, 7]。此外腎髒、血液係統及骨關節等器官係統，也會（huì）出現相應的臨床症狀和體征。

患者出現以下一些症狀或指標可供臨床診斷：

1. 角（jiǎo）膜K-F環是某些WD患者一個比較明顯的特征（zhēng）。K-F環為（wéi）角膜邊緣的（de）黃綠色或黃灰色（sè）色（sè）素環，一般（bān）在手電筒側光照射下肉眼可見（jiàn），7歲（suì）以下（xià）患者一般無法檢（jiǎn）出角膜K-F環。

2. 肝脾檢查（chá）：肝功能血清轉氨酶、膽紅素升高和（或（huò））白蛋（dàn）白降低；肝脾B超：常顯示（shì）肝實質光點增粗、回聲（shēng）增強甚至結節狀改變；部分患者脾髒腫（zhǒng）大；肝髒MRI檢查常顯示肝脂質沉積、不規則結節及肝葉萎縮等。

3. 采用銅代謝相關生化檢查，銅藍蛋白<120mg/L，24小時尿（niào）銅≥100μg。

4. 顱腦MRI檢查主要表現為殼核、尾狀核頭部、丘腦、中腦（nǎo）、腦橋及小（xiǎo）腦T1低信號、T2高信號，少數情況下可出現T1高信號或T1、T2均低信號。

5. 基因篩查（chá）：對於臨床證據不足但又高度懷（huái）疑WD的患者（zhě），篩查ATP7B基因致（zhì）病變異對診斷具有指導意義。

圖2. 角膜邊緣黃色渾濁的K-F環

03、ATP7B突變類型及地理分布

ATP7B基因突變在不同種族和（hé）地域中存在遺傳異質性。歐洲人群最常見的突變類型是14號外顯子上的 H1069Q突變（biàn），在意大利、瑞典和羅（luó）馬尼亞等地多（duō）見，臨床主（zhǔ）要以錐體外係症狀為主，如震顫、肌張力障礙、精神症狀等。亞洲（zhōu）人群最（zuì）常見（jiàn）的突變類型是 8號外顯子上（shàng）的錯義突變R778L，以中國、韓國（guó）和日本最（zuì）多見（jiàn），臨床以肝髒方麵症狀為主，如肝（gān）功能異常、肝硬化、肝脾大等；其餘常（cháng）見的還（hái）有 P992L、Q1399R等[8]。

04、肝豆狀核變性動物模型

1. “毒乳”( toxic milk，TX)小鼠

肝豆（dòu）狀核變（biàn）性動（dòng）物模型中最有名的是一種“毒乳”( toxic milk，TX)TX小鼠。 “毒（dú）乳”小鼠這一名稱源自雌性純合子TX小鼠乳汁中缺乏銅，因此其哺乳的幼鼠在2周左（zuǒ）右時會由（yóu）於銅缺（quē）乏而死亡。後續研究證明“毒乳”為ATP7B基因突（tū）變小鼠。

TX小鼠又分為兩種，一種是1974年由Harold Rauch在（zài）DL近交係小鼠F68代（dài）中發現的自然突變，後（hòu）來（1996年）被鑒定為（wéi）ATP7B基（jī）因外顯子20中4066位的A到G堿基變化，導致第八跨膜區M1356V（甲（jiǎ）硫氨酸to纈氨酸）的（de）改變。TX鼠於第3周開（kāi）始出現銅在髒器的（de）沉積，首先（xiān）是肝髒和腦，以肝髒為重，至第4個月銅沉積最（zuì）為顯著，可達對照組的60~80倍。同期（qī）腎髒亦有大量沉積。這種由肝至腦再到腎的銅沉積過程與WD患（huàn）者的（de）一般臨（lín）床病程相似[9]。

另一種TX小（xiǎo）鼠是1987年在傑克遜實驗室的C3H/HeJ群體（tǐ）中出現的自（zì）然突變品係TX-J小鼠，現對外出售，編號001576。該突變小鼠是ATP7B基因外顯子8中2135位的G到A的堿基突變。與TX小鼠相似（sì），TX-J小鼠與WD患者以相似的方式在肝髒中積累銅，成年純合子TX-J小鼠會發展為肝硬（yìng）化。

TX和TX-J小鼠不能完全模擬WD患者，其角膜無K-F環；與WD患者的肝（gān）髒損傷也有顯著差異；且沒（méi）有關於人類WD母親的嬰兒銅（tóng）缺乏現象的報（bào）告；另外TX小鼠缺乏明顯神經係（xì）統症狀，TX-J小（xiǎo）鼠也隻有輕微的（de）行為異常。但TX和（hé）TX-J小鼠（shǔ）ATP7B mRNA的（de）轉錄水平沒有明顯改變且ATP7B基因功能部分保（bǎo）留，並（bìng）具有（yǒu）與WD患者相（xiàng）類似的病（bìng）理過程和銅生化特征，同時也由於其容易獲得，是目前（qián）使用最多的WD動物模型之一，廣泛應用於一些治療藥（yào）物的試（shì）驗。

2. ATP7B基因修飾小鼠

利（lì）用同源（yuán）重（chóng）組（zǔ）技術或CRISPR基因編輯技術敲除ATP7B基因第2外顯（xiǎn）子獲（huò）得的ATP7B-/-基因敲除（chú）小鼠也（yě）越來越多的被用於WD研究。ATP7B-/-基因敲除小鼠具有與（yǔ）人類WD和TX小（xiǎo）鼠相似的（de）銅沉積表型，但與TX鼠模型相比發病較早且肝損傷更（gèng）嚴重，肝炎、壞（huài）死性炎症、膽管增殖、纖（xiān）維化，甚至後續的（de）腫瘤發生等症狀都比TX鼠更接近人類WD的肝髒病理結果。

隨著基因編輯技術的進（jìn）展，采用基因編輯工具CRISPR/Cas9+ssDNA[10]，或（huò）采用堿基編輯（Base Editor）、先導編輯（Primer editor）技術，結合胚（pēi）胎操作術可以（yǐ）較輕鬆地在小鼠ATP7B基因（yīn）上構建與人類WD同源的突變位點。理論上可以（yǐ）獲得更接近（jìn）人（rén）類WD特征的小（xiǎo）鼠模型。

3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

LEC大鼠是一種近交（jiāo）係突變大鼠，最初是從Long–Evans大鼠群體中（zhōng）分離出來的，它的ATP7B基因（yīn）在3’端編碼（mǎ）區缺失了（le）900個堿基，以（yǐ）及下遊未翻譯區缺失了約400個堿基。LEC大鼠主要表現出自發性肝（gān）銅異常積聚伴隨（suí）低血清銅和低銅藍蛋白，大約（yuē）4月（yuè）齡時出現暴發性肝炎或暴發性肝衰竭、轉氨酶和膽紅素（sù）升高，部分或大量肝細胞壞死，病死率至少30%～40%，存活下來的大鼠多在12月齡時發生肝纖維化並伴有肝細胞癌和膽管癌。由於肝病（bìng）進展（zhǎn）迅速，LEC大鼠特別適合幹預治療（liáo）研究，如（rú）各種排銅絡合劑和幹細胞治療研究等。

圖3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大（dà）鼠（shǔ）

4. 其他大型哺乳動物模型

一些大（dà）型哺乳動物在銅代謝方麵也存在遺傳缺陷，均表現出銅在肝髒中（zhōng）積累和銅毒性，例如犬(杜賓犬、拉布拉多尋回犬、貝靈頓梗犬（quǎn）Bedlington Terrier)和北羅（luó）納德（dé）賽羊等（děng）。然而（ér）這些大型哺乳動物銅代謝方麵的遺傳缺陷與（yǔ）人（rén）類WD並不相同，如貝靈頓梗犬，導致其肝銅積累的遺傳缺陷是由於COMMD1（MURR1）基因39.7kb的刪除，而非ATP7B基因，故作為人類WD模型的作用有其局限性[11, 12]。若能在大（dà）型哺乳動物甚至非人靈長（zhǎng）類動物的ATP7B基因中引（yǐn）入（rù）突變（biàn），或將造就（jiù）更好模擬人類WD的動物模型。

05、肝（gān）豆狀核變性的治療（liáo）

在目前的治療方案中，WD患者需進行終生治療，主要（yào）目標為治療銅過（guò）載。基本原則（zé）包括（kuò）低銅飲食：避免或限製富含銅的食（shí）物，如肝髒、水生貝殼類動物、堅（jiān）果、巧克力、豆類、蘑菇等。藥物治療方（fāng）麵以青黴胺、曲恩汀為代表的金屬絡合劑增加銅的排除（chú），以鋅劑為代表的藥物減少銅的吸收。治療越早越好，患者（zhě）通常不能停藥，因為治療中斷很可能導（dǎo）致失代償（cháng）性肝損傷及（jí）神（shén）經不可逆損傷。

值得注意的是WD的藥物治（zhì）療有一（yī）定的局限性，除需要終生（shēng）治（zhì）療外，約1/3 WD患者用藥期間會出現與藥（yào）物相關的不良事件，導（dǎo）致不得不（bú）更換藥（yào）物，甚至可能導致治療失敗，WD晚期（qī）導致（zhì）的肝衰竭或失代償期（qī）肝硬（yìng）化需要（yào）進（jìn）行肝移植（zhí），這可能是（shì）最後（hòu）的常規治療手段。

鑒於（yú）WD是非常明確的由ATP7B基因突變所（suǒ）致的疾病，因此基因治療或（huò）許有廣闊的（de）前景。目前已有基於動物（wù）模型的WD基因（yīn）治（zhì）療研究。如Murillo等在研究中用（yòng）編碼人ATP7B cDNA的AAV8載（zǎi）體轉導到ATP7B-/-小鼠模型的肝髒，發現治療後血清轉（zhuǎn）氨酶降低，尿銅排泄（xiè）量減少，血清全血漿蛋白的正常（cháng）化[13]。此（cǐ）外，2019年Liu等通（tōng）過CRISPR/Cas9替（tì）換了小鼠模型中ATP7B基因的第8外顯子[14]；2020年Michael等使用（yòng）CRISPR/Cas9+ssODN的（de）方法糾正人類細胞係中的ATP7B點突變[15]。筆者嚐試用一種ABE堿基編輯器輸入到TX-J小鼠（shǔ）肝髒，觀察到了小鼠血清轉氨酶降低，以及低比例的肝細胞ATP7B點（diǎn）突變被（bèi）糾正（數據不展示（shì））。總之，基（jī）因治療的進展為WD患者帶來了希（xī）望，但基（jī）因治療還處於基礎研究到臨（lín）床研究轉化的階段，還有很多不成熟的地方需要不斷完善和革（gé）新。期望它將來能成為治療肝豆狀核變性的一線（xiàn）療法。

參考文獻：

1.Wilson, S.A.K., Progressive lenticular degeneration. A familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver. Lancet, 1912. 1: p. 1115-1119.

2.Gomes, A. and G.V. Dedoussis, Geographic distribution of ATP7B mutations in Wilson disease. Annals of Human Biology, 2016. 43(1): p. 1-8.

3.Rodriguez-Castro, K.I., F.J. Hevia-Urrutia, and G.C. Sturniolo,Wilson’s disease: A review of what we have learned. World journal of hepatology, 2015. 7(29): p. 2859.

4.Ariöz, C., Y.Z. Li, and P. Wittung-Stafshede, The six metal binding domains in human copper transporter, ATP7B: molecular biophysics and disease-causing mutations. Biometals, 2017. 30(6): p. 823-840.

5.Liver, E.A.F.T.S.O.T., EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. Journal of hepatology, 2012. 56(3): p. 671-685.

6.Guggilla, S.R., et al., Spectrum of mutations in the ATP binding domain of ATP7B gene of Wilson Disease in a regional Indian cohort. Gene, 2015. 569(1): p. 83-87.

7.Hedera, P., Update on the clinical management of Wilson’s disease. The application of clinical genetics, 2017. 10: p. 9.

8.黃豔，劉誌峰（fēng）, 肝豆狀核變性ATP7B基因突變的研究進展.醫學綜述, 2019. 025(009): p. 1717-1721.

9.Harold and Rauch, Toxic milk, a new mutation affecting copper metabolism in the mouse. J Hered, 1983. 74(3): p. 141-144.

10.朱基彥, et al., 利用CRISPR/Cas9構建（jiàn）R778L類型肝豆狀核（hé）變性疾病小鼠模型.基礎醫學與臨床, 2018. 38(12): p. 6.

11.楊玉（yù）龍, et al., 肝豆狀（zhuàng）核變（biàn）性動物模型的研究進展.臨床（chuáng）肝膽病雜誌, 2022. 38(5): p. 6.

12.Fieten, H., et al., New canine models of copper toxicosis: diagnosis, treatment, and genetics. Human Disorders of Copper Metabolism I, 2014. 1314: p. 42-48.

13.Murillo, O., et al., Long-term metabolic correction of Wilson's disease in a murine model by gene therapy. Journal of Hepatology, 2016. 64(2): p. 419-426.

14.Liu, L.L., et al., Exon Replacement in the Mouse Gene by the Cas9 System. Human Gene Therapy, 2019. 30(9): p. 1079-1092.

15.Pöhler, M., et al., CRISPR/Cas9-mediated correction of mutated copper transporter ATP7B. Plos One, 2020. 15(9).