實驗動物非常規眼科檢查簡介

如前文（wén）《實（shí）驗（yàn）動物的常規眼科檢查》一文中所寫（xiě），眼科檢查的（de）操作流程可因（yīn）動物種屬和特點的研究目的而（ér）異。如果目的是篩查藥物等物（wù）質對眼部組織的（de）不良影響，則（zé）應至少進行間接檢眼鏡和裂隙燈顯微鏡的檢查。根據檢查目的，也可執行其它程（chéng）序，比如角膜染色、角（jiǎo）膜知覺檢查、角膜厚度測量、眼壓（yā）計、眼底照相（xiàng）、熒光血管造影、光學相幹斷層掃（sǎo）描 (OCT, Optical Coherence Tomography) 和視覺係統的電生理評估（例如視網膜電（diàn）圖、多焦視網（wǎng）膜電圖（tú）、視覺誘發電位）。

許多無創（chuàng）性（xìng）眼科診斷（duàn）技術，可同時提（tí）供眼前節與眼後（hòu）節的結構和功能信息。下麵討論了其中一些（xiē）技術，對這些技術適用於毒理學（xué）、眼科研究和臨床應用的場景進行了初步討論。

01、眼壓測量

眼壓計用於（yú）獲得眼內壓 (IOP, Intraocular Pressure) 的間接測量值。市麵上有幾種不同的（de）商品化的手持式設備，其（qí）便攜性足（zú）以供眼科檢查人員使用，如壓陷、壓（yā）平（píng）或回彈式眼壓計（jì）。對於合同（tóng）研發組織（CROs, Contract research organizations）使用（yòng）的多種（zhǒng）動物（wù）種屬，通常認為（wéi）Schiotz壓陷式眼壓計的結（jié）果不準確、不可靠，因此不應用於眼部毒理學（xué）研究。由於許多眼壓計最（zuì）初設計用於人的角膜，用於動物的讀（dú）數可能略不準確，但如果在整個研究期間由同一名檢查者使用相同的眼（yǎn）壓計（jì），則研（yán）究中發生的（de）眼壓變（biàn）化（huà）將是有效的。

大多數實驗動物的 IOP 範圍為 12-25 mmHg，雙眼之間的差異應≤5 mmHg。IOP 可受到多個變量的影響，如：保定技術、動物應激、晝夜節律眼位（wèi）、鎮靜或麻醉、角膜厚度等。如果（guǒ）可能，在進行眼壓（yā）測量時，應在整個研究期間保持（chí）如下細節的統一：每天相同的測量時間、相同的眼壓計和操作技術、同一組檢查人員和保定人員，來測量試驗內所（suǒ）有動物（wù）的 IOP。應在散瞳之前測定眼壓。當眼壓測量是研究的關鍵點時，建（jiàn）議（yì）研（yán）究開始（shǐ）前先對動物（wù）進行保定（dìng）適應和操作適應。

最常使用的是壓平式眼壓（yā）計，如Tono-Pen XL®、Tono-Pen Vet®、Tono-Pen AVIA® ，或非接（jiē）觸式眼壓計。眼壓測量需表麵麻醉時，0.5% 丙（bǐng）美卡因（yīn）是最常見的選（xuǎn）擇。該技術測（cè）量壓平角膜給定區（qū）域所需的力，然後將（jiāng）該施加力轉換（huàn）為眼壓值（zhí）（單位：mmHg）。一些壓平式眼壓（yā）計具有自我校準（zhǔn）的優勢（圖1），而非接觸式眼壓計可提供紙質（zhì）副本用於記錄保存，兩者都是（shì）藥物非（fēi）臨床研（yán）究質（zhì）量管理規範（GLP，Good Laboratory Practice）類研究的理想（xiǎng）技術。Tono-Pen XL 和 Tono-Pen Vet® 產生4個獨立讀數，可對讀數取平均值，並顯示IOP和誤差百分比，即單個讀數之間變異性。Tono-Pen AVIA® 產生10 個獨立讀數（shù），並（bìng）以置信度百分比報告 IOP 和（hé）變異性（xìng）。對於 Tono-Pen XL®，誤差百分（fèn）比應 <5%，而對於 Tono-Pen AVIA®，置信度百分比應 >95%。

圖1 Tono-Pen AVIA Vet® 用於（yú）測量Dutch Belted Rabbit的眼壓

回彈（dàn）式眼壓（yā）計通過向角膜發射一個小的塑料（liào）探針（zhēn）頭（tóu）來確定眼壓，然後探頭反彈回（huí）設備中（zhōng），產生感應電流（liú），由此計算眼壓（yā）值。為了準確測量，探針必須以水平（píng）位置在角膜上擊（jī）發，即探針與地板平行（háng）。實驗動物最常用的（de）回彈眼壓計是 Tonovet®（圖2a）。Tonovet® 專門針對（duì）犬、貓和馬進行了校準，但也已在其它種屬中可靠地使用。TonoLab 眼壓（yā）計是專門為小鼠和大鼠設計和校（xiào）準（zhǔn）的（圖2b）。在許多實驗動物中，包（bāo）括犬、兔和大鼠（shǔ），Tonovet 和 TonoLab 眼壓計具有不需要局部麻醉（zuì）的優點（diǎn），並（bìng）且比 Tono-Pen® 更容易獲得 IOP，其缺點是（shì）在使用前（qián）不（bú）能自行校準。與 Tono-Pen® 和 Tonovet® 一樣，它也取6 個讀數的平均值，並（bìng）使（shǐ）用眼壓值的（de）左側欄指示誤差百分比。測量時，應沒有錯誤（wù）欄，或（huò）者欄應該位於屏幕的左下角，以使讀數可以接受。

無論使用何種（zhǒng）眼壓計，通常每隻眼應（yīng）獲得（dé）並記錄至少 2-3 個最（zuì）終平均讀數。由於除（chú）非（fēi）接觸式外的所有（yǒu）眼壓計僅給出數字讀數，設備不（bú）會創建永久性（xìng）記錄，因（yīn）此必須手（shǒu）動記錄 IOP 或將其輸入計算機（jī）數據庫中。

圖2 (a) The Tonovet® 回彈式眼壓計測量New Zealand white rabbit眼壓 (b) TonoLab 眼壓計小小的尖端（duān）可用於齧齒類的眼壓測定

02、角膜厚度測量（liàng）法

角膜厚度測量法是一種無創性（xìng）評價（jià）角膜厚度的方法。最常（cháng）使（shǐ）用專門為此目的設計的接觸式超（chāo）聲設備（例如 PachPen®）進行（圖3），但也可以通過（guò）高分辨率超聲檢查或光學（xué）相幹斷層掃描（OCT, Optical Coherence Tomography）獲得角膜厚度的測量結果。在角（jiǎo）膜水（shuǐ）腫可被生物顯微鏡檢測（cè）出之前，角膜厚度（dù）測量法可對角膜厚度的細（xì）微（wēi）變化進行評價（jià）。角膜厚度可因（yīn）種屬的（de）不（bú）同，以及角膜區域不同（軸向（xiàng）或（huò）周（zhōu）邊）而變化。由於（yú）區（qū）域差異，必（bì）須在每（měi）個（gè）時間點從角膜（mó）的相同區域進行測量，通常選用軸向。

圖3 PachPen 測量New Zealand white rabbit角膜厚度（dù）

03、熒光素染色法

在涉及眼（yǎn）局部給藥、角膜（mó）接觸鏡評價的（de）研究，和使用改（gǎi）良 Hackett-McDonald 評分係（xì）統的其他研究中，通常使用熒光素鈉溶液評價角膜上（shàng）皮（pí）的完整性。熒光（guāng）素是一種水溶性熒光染料，可被親水性角膜基質保留，但不被（bèi）角膜上皮保留（liú）。它可用（yòng）於輔助識別角膜上皮缺損，也可用（yòng）於評價角膜前的（de）淚膜滯留。熒光素以單個浸漬（zì）條（tiáo）帶的形式（shì）提供，使用時使用無菌生（shēng）理鹽（yán）水潤濕。將濕潤的條帶輕輕塗抹在背側球結膜上，注意不要接（jiē）觸角膜。然後使用鹽水輕輕衝洗多餘的熒光素。或者，可將熒光素條置於塑料注射器中，並加（jiā）入預（yù）定體積的無（wú）菌生理鹽水，以（yǐ）產生已知熒光素濃度的（de）溶液，然後滴在角膜上。由眼科檢（jiǎn）查人（rén）員（yuán）使用（yòng）帶有鈷藍濾光片的生物顯微鏡對角膜進行（háng）檢查（chá），觀察（chá）是否有殘留的熒光。

04、眼部照相

眼部照相可用來證明眼底（dǐ）等區域（yù）無變化，或記錄異常以及監測（cè）病變的進（jìn）展。可在研究期間的不同時間點拍攝照片來進行比較，以準確（què）地確定異常是靜態的還是進行性（xìng）的。由於照（zhào）相增加了額外的時間、成本和動物應激，因（yīn）此並非所有研究均（jun1）需進行。在觀察到病變時，或很可能引起眼部異常的研究中（例如眼內植入物，玻璃體內或視網膜下注射研究），可在研究方案中將（jiāng）其作為一種記錄（lù）病變的選（xuǎn）擇。

眼部照相可分為（wéi）眼外部和眼內部。眼外（wài）部的拍攝可使用帶有微距透鏡的標準單鏡頭反光（SLR, Single Lens Reflex）數碼相機，或（huò）帶屈光度設置調（diào）節以（yǐ）允許眼外部和眼前節成像的數字 Kowa Genesis-D 眼底照相機。眼（yǎn）後節的拍攝需要特定類型的眼（yǎn）底照相機，數字化Kowa Genesis-D 照相機、RetCam、Phoenix Micron IV 和 Micron X 適用於大多數實驗動物的拍攝（shè）（圖4）。這些照相機可適（shì）用於間接（jiē）眼部照相、齧齒類動物眼底照相和熒光血管造影。眼（yǎn）底照相的優點是能夠永久保存（cún）記錄，以比較潛在的研究相關結果，如果有發現，則可由另（lìng）一（yī）名眼科檢查再次進行獨立審閱。

在拍攝（shè）照片時，所有照片都應使用相（xiàng）同的（de）放大倍率和照明設置。此外，所（suǒ）有動物均應按相同（tóng）眼別順序（左和右）進（jìn）行拍攝，同時應保存動物標識和設備日（rì）誌等拍攝記錄。上述標準也（yě）可作為標準操作規程 (SOP, Standard Operating Procedures) 的一部分。

圖4 可用於實驗動（dòng）物的（de）眼底相機

05、熒光血管造影

熒光血管造影可用於評價眼（yǎn）內動脈和靜脈的血管完整性。雖然其最常用於檢查視網膜和脈絡膜的血管，但也可用於檢查虹膜（mó）血管。在（zài）毒理學研究中最常用於評價供試品對（duì）於新生血管形成的影響。目前，它已被（bèi）應用於（yú）多種實（shí）驗動物，最常選用的是10%熒光（guāng）素鈉，也有部分研究選擇吲哚菁綠。

熒光血管造影技（jì）術需要散瞳，並進行（háng）鎮靜或麻（má）醉（zuì）。將（jiāng）光可激發的化合物熒光素靜（jìng）脈注射，可獲得目標組織（脈絡（luò）膜視網膜和虹膜）的一係列定時圖像（xiàng）。與熒光素注射相關的並（bìng）發（fā）症可能包括滲漏後組織刺激、嘔吐和過（guò）敏反應。必須在（zài）能夠拍攝多（duō）幅、快速排序圖像的眼底照相機上使用激發濾（lǜ）光片 (490 nm) 和屏障濾光（guāng）片 (520-520 nm)。Kowa Genesis-Df、RetCam Shuttle、Phoenix Micron X 和 Heidelberg Spectralis cSLO 可用於（yú）熒光血管造（zào）影，且（qiě）是便攜（xié）式的（圖4）。在注射熒光素前，先拍攝對照的彩色圖（tú）像，然（rán）後每 20s 拍攝一組，獲（huò）得連續圖像。由於熒光素填充脈絡膜視網膜血管，因（yīn）此描述了血管流動的各個階段。它們包括動脈前期、動脈期、動靜脈期、靜脈期及後期。熒光血管造影觀察到的異常可能包括血管異常（動脈瘤（liú）、新生血管形成（chéng））、熒光受阻、熒光素滲漏、低熒光和高熒光。

06、視網（wǎng）膜電圖/視覺誘（yòu）發電（diàn）位（wèi）

根據毒理學研究目的，以及可能受影響的視覺係統的（de）特定方麵，有多種電生（shēng）理（lǐ）學試驗可用於評價視網膜和視覺通路。視網膜電圖 (ERG, Electroretinography) 是測量視網膜在（zài）受到光刺激時產生的電勢。標準 ERG 是一種全視野刺激，可（kě）提供關於整個視網膜的信息，是視網膜色素上皮、光感受器和（hé）內層視網膜的群體反應。對於局部視網膜評價（jià）可選用多（duō）焦視網膜電圖 (mfERG, multifocal electroretinogram)。對（duì）於黃斑區（qū）神經節細胞的評價（jià）可選用圖形倒轉視網膜電圖（tú） (PERG, pattern reversal electroretinogram)。而為（wéi）了評價從視網膜（mó）到視覺（jiào）皮（pí）層的整個視（shì）覺通路，視覺誘發電位 (VEP, visual evoked potential) 則是首選技術。在這些試驗中，全視野 ERG最常用於臨床前毒（dú）理學試驗。ERG 提供了（le）一種非（fēi）侵入性的可重複評估視網膜功能的方法，它可結合間接檢眼鏡和組（zǔ）織（zhī）病理學來對視網膜結構和功能進行綜合評估。

ERG應（yīng）在散（sàn）瞳後按標準流程（chéng）進行，目前人（rén）和犬的（de）ERG有許（xǔ）多可參考的國際指南，可作（zuò）為試驗設計的參考。在獲得全視野（yě）ERG過程中，如下條件建議保持（chí）一致：房間照明情況、暗適應（yīng）、閃光強度、頻率以及使用的鎮靜或麻醉劑劑量。

07、光學相幹斷層掃描

光學相幹斷（duàn）層掃描是（shì）一種高分辨率的（de）無創成像技術，可提供眼部結構的實時橫斷麵圖像（xiàng），最常用於視網膜和視神經，其軸向分辨率為 2-10 μm，也可用於眼前節的成像。與許多先進的成像技術一樣，它需要鎮靜或麻醉、散瞳和專門的設備。當進行 OCT 成像時（shí），可看到所有的單個視網膜層，並測量其厚度，以便隨（suí）時間進行定量（liàng）和多次重複評價。其可測量（liàng）視盤的杯麵積、盤麵積、杯直徑、盤直徑以（yǐ）及（jí）邊緣麵積。通過 OCT 對前（qián）節進行檢查則可了解角膜、前房、虹膜和虹膜角膜角的（de）結構信息，且其無需像（xiàng）超聲生物（wù）顯微鏡 (UBM, ultrasound biomicroscopy) 所需的那樣接觸角膜。它還提供了比 UBM更高的（de）軸向分辨率（lǜ）。OCT 在實驗（yàn）動（dòng）物（wù）中（zhōng）已應用於多個種（zhǒng）屬，其在人類疾病動物模型和臨床前試驗中的應用也將越來越多。

隨著技術的進步，頻域 OCT (SD-OCT, spectral-domain OCT) 使用非機械技術，比傳統 OCT 或時域 OCT (TD-OCT, time-domain OCT) 明顯（xiǎn）更快。SD-OCT 同時測量一個光譜中多個波長的反射光，因此被稱為光譜域。SD-OCT 比 TD-OCT 快 100 倍，每（měi）秒可采集 70,000 + 次 A-scan，其掃描速度和（hé）次數的增（zēng）加可（kě）轉化為更高分辨率。

08、角（jiǎo）膜內皮顯微鏡檢（jiǎn）查（chá）

角膜內皮顯微鏡可對角膜內皮細胞進行活體非侵入性的成像（xiàng）觀察，可采用接觸或非接觸方法進行（háng）。一旦可視化，可（kě）評價角膜內皮細胞的細胞形態，並可定量為每 mm 的細胞數量。正常角膜內皮細胞排列規則，呈六角形。內皮顯微鏡可評價細胞的密度、多形性（xìng）和變異情況。由於細胞數量可因動物年齡和角（jiǎo）膜區域的不同而變化，因（yīn）此須使用相同年（nián）齡的動物（wù）對這些變量（liàng）進行（háng）標準化，並檢查軸向角（jiǎo）膜。須對動物進行鎮靜或麻醉，以獲得準（zhǔn）確的圖像，並可適用於簡化技術的自（zì）動化係統。FDA 已經設（shè）立了關於臨床試驗中角膜（mó）內皮顯微鏡檢查的指南，這些指南可（kě）以作為臨床前研究設計的起點（diǎn）。除角膜內皮顯微鏡外，還可選用體內高分辨率共聚焦顯微（wēi）鏡 (Heidelberg Retina Tomograph with Rostock Corneal Module) 進行角（jiǎo）膜內皮成像和分析（圖5）。